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昆虫细胞的低MOI杆病毒感染 - 实验方法
来自 : 发布时间:2024-12-25

 

感染悬浮细胞是使杆病毒系统生产蛋白的普遍方法。悬浮培养的细胞很容易从 10ml 扩大到 100L 。一般来说,悬浮的细胞在无血清的培养液中培养。这种培养液许多公司有售,比如 Life Technologies 、 Hyclone 、 Biowhitaker 、 JRH Biosciences 、 Expression Systems 等,用起来都不错,尽管由于细胞株和目的蛋白的不同,效果有所差异。

最好是将目的蛋白和细胞株用不同的培养液做一个表达试验,选出表达效果最好的一种培养液。在进行这个表达试验之前要先使你的细胞株分别适应不同的培养液(见上文),否则试验结果不具有代表性。

注意:为了优化表达,你必须了解你的细胞的生长参数;为了方便新手,我将列出一些生长参数通常的值。我最喜欢的 Sf9 细胞株可以最低以 2 × 105 细胞 /ml 的浓度分装,并且恢复几乎没有滞后期。在对数期, 20 个小时细胞数目就可以翻倍,浓度最高可以达到 5 × 106 细胞 /ml 。下面的实验步骤将以上面列出的生长参数为前提。如果你的细胞株生长参数有所不同,你需要对实验步骤做出合适的调整。

低 MOI 感染简介

 

低 MOI ( Multiplicity Of Infection ,等于用于感染的病毒数目与细胞数目的比值)感染是扩增病毒的最好方法。这有两个原因。一方面,低 MOI 感染是最快也是最简单的扩增病毒数量的方法;另外,低 MOI 感染是保存病毒基因的完整性、防止 DIP ( Defective Interfering Particles ,即只包装入部分基因组的病毒颗粒)生成的最好方法。

还可以用低 MOI 感染的方法生产蛋白,但是难以控制,并且不适于提高蛋白产量。然而病毒需要量少的确是该法的一个优点,对于大规模的生产这个优点极为有利,只要它们可以可靠的复制,这因不同的重组病毒而异。对于小规模的蛋白生产,我更喜欢用高 MOI 感染。

一般而言,低 MOI 感染的方法就是先用病毒感染少量细胞,这些被感染的细胞复制出足够的病毒,去感染培养物中剩余的尚未被感染的细胞,而这第二批被感染的细胞就是病毒或者蛋白的主要生产者。

重要的是培养液的量要满足细胞生长的需要,否则将没有足够的营养使细胞生产病毒或者蛋白。另一方面,病毒也不可以太多,以免在细胞增殖到合适密度并用掉所有营养资源之前就被杀死。最理想的是,先确定在没有病毒感染时,细胞保持正常状态所能达到的最大密度,那么如果病毒的量能够使细胞在达到该密度的 1/3~2/3 时停止扩增是最理想的。我通常是使用该密度的 1/2 。

采用这个方法需要使用足够的病毒感染细胞,在 24~48 小时内使细胞停止增长、所有的细胞都被感染。因此,以生长停止作为完全感染的标志,培养物在达到完全感染后可以继续生长大约 48 小时。如果以生产蛋白为目的,这个过程可能需要更长。

步骤:

 

将细胞以 2~4 × 105 细胞 /ml 的密度分装到摇瓶中,达到摇瓶体积的 20~40% 。在 27 ± 2 ℃培养,转速为 100~130rpm 。

第 0 天

 

培养细胞至密度达到 4~8 × 105 细胞 /ml ,即已经进入对数期生长,但是仍处于低浓度。

然后加入少量病毒,病毒量依赖于滴度,但是最好使 MOI 值介于 0.1~0.5 。比如,如果你的细胞浓度为 6 × 105 细胞 /ml ,而病毒滴度为 3 × 107 pfu/ml ,那么要使 MOI 介于 0.1~0.5 ,所加的病毒的体积应该是细胞体积的 0.2~1% 。

将摇瓶放回 27 ℃摇床,培养 24 小时。

感染后第 1 天

 

计数细胞,估计细胞大小。如果病毒的实际滴度比估计的高,即 MOI 值高于 0.5 ,你将看到明显的细胞停止生长和肿胀的迹象;反之,如果 MOI 值接近 0.3 或者更低,你将看到细胞几乎没有受到病毒影响,它们的数目扩增到接近 1.2 × 106 细胞 /ml ,并且看起来健康。这个时候,被感染的细胞应该正在释放病毒至培养液中,去感染其它细胞。

感染后第 2 天

 

再次计数细胞并且估计细胞的大小。此时大多数细胞应该已经被感染。细胞的数目应该远远低于 2.4 × 106 细胞 /ml (这是在没有病毒感染的情况下细胞正常生长应该达到的密度),并且明显膨胀。

如果细胞的数目在感染后第 0 天和第 1 天之间没有增长,可能是所有的细胞都被同时感染所致,在感染后第二天就可以收获了。如果不是这种情况,将摇瓶放回 27 ℃摇床,培养 24 小时。

感染后第 3 天

 

再次计数细胞,估计细胞大小。如果实验进展与预料一致,此时的细胞数目与第 2 天比应该没有增长。

如果细胞数目在感染后第 1 天和第 2 天之间就已经停止增长,这说明所有的细胞在感染后第 1 天就已经被全部感染,此时可以收获细胞,因为感染时间已经达到 48 小时,这是一般的情况。

如果细胞数目在感染后第 1 天和第 2 天之间仍然有一定增长,并且此时尚未达到平台期,将摇瓶放回 27 ℃摇床,培养 24 小时。

感染后第 4 天

 

再次计数细胞,估计细胞大小。此时最好所有的细胞都被彻底感染、膨胀、生长停止,否则说明用于感染的病毒的量不够,不能在细胞生长达到平台期前使其停止。此时应该收获培养物,离心分离细胞,将培养液避光保存于 4 ℃,或者冻存于 -70 ℃。

通常最好将细胞沉淀冻存。我喜欢的方法是将细胞重悬于小量(比如 1/4 体积)的 PBS 或者 TBS (含有浓度为通常 5 倍的蛋白酶抑制剂)中,充分重悬后直接用微量移液器加入充满液氮的干净 Dewar 瓶中。滴下的重悬物遇到液氮迅速冻结形成小球,这些小球可以被分装到 50ml 圆锥管中,冻存于 Revco 冰箱中。当需要从细胞中纯化蛋白时,只需将这些小球逐个加入到 3~5 倍体积室温下不断搅拌的裂解缓冲液中,它们将很快融化,使缓冲液降至接近 0 ℃。这些小球还可以用镊子方便的转移到 eppendorf 管中作小量实验。

 


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发布于 : 2024-12-25 阅读()